本文综合北京大学官网、知乎内容

《Science》12月2日发表了北京大学周德敏/张礼和课题组的突破性研究成果。他们以流感病毒为模型，发明了人工控制病毒复制从而将病毒直接转化为疫苗的技术，即在保留病毒完整结构和感染力的情况下，仅突变病毒基因组的一个三联码，使流感病毒由致命性传染源变为了预防性疫苗，再突变三个以上三联码，病毒由预防性疫苗变为治疗病毒感染的药物,并且随着三联码数目的增加而药效增强。

该技术不仅使疫苗研发不再复杂，而且摆脱了对病毒生物学知识获得的依赖，并适用于几乎所有病毒。这一发现颠覆了病毒疫苗研发的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。该研究一经发布，便在国内外迅速引起巨大轰动。

知乎上一部分专业网友的评价如下：

@Vigorous Cooler ：这真是个巨大的突破，突破了原有减毒活疫苗的设计框架，等于是直接开创了新的疫苗制备体系，前景不可限量。

@Cpf1：感谢Vigorous Cooler 的详细介绍和精彩点评。还没来得及看全文，通过答主截图的figure大致了解了文章，真的是非常精彩而且完备细致的研究，在science上发表当之无愧，在这里向作者致敬。

@gyroscope：本人不是生物专业的，论文的前半部分我都看不懂，什么正交系统，PTC之类的看的我一脸懵逼。但论文的大意我是比较清楚的，它相当于找到了一种构造病毒活疫苗的简便的方法，可以适用于多种病毒，而且不用担心造成感染。这种方法的价值一方面可以用于没有疫苗的病毒，另一方面可以改进已有的疫苗。

@张浩千：在此Science论文之前，使用非天然氨基酸插入技术做疫苗这个技术路线有人已经摸清楚了，发表在Angew Chemie int上，北大化院的陈鹏老师还写了评论文章。这次能发Science，一是流感这个病毒模型选得特别好，二是数据确实好，特别是最后两幅图。周德敏和张礼和老师能把基础技术转化到应用层面，为大家展现非天然氨基酸插入技术的巨大应用前景，已经非常厉害了。

@刘力行：太牛逼了！居然不会恢复毒性，还能给野生型减毒，简直要上天。

@王祖贤：说个题外的。一作的两位师兄师姐是06级的，也就是他们今年应当还不到30岁。

……

全球最大的科技新闻工作站SciPak将该发现作为亮点，于美国东部时间12月1日下午2：00向全球媒体发布。随即新华社、纽约时报、华尔街日报、加拿大广播公司和香港南华早报等媒体相继跟进，对这一重大发现进行了专题报道。《Nature》杂志也对此突破性进展给与了高度评价，认为周德敏及其北京大学同仁们建立的方法将被广泛用来制备更高效的病毒疫苗。

为了及时给大家传达这一具有重大医学价值和社会意义的研究成果，医药魔方与知乎优秀答主@Vigorous Cooler第一时间取得联系并获得授权，将其在知乎上关于该研究相关背景和技术方法的讲解分享给大家：

Si L., Xu H., Zhou X., et al. Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication-Incompetent Virus Vaccines. Science, Dec 2, 2016.

背景信息

（甲型）流感病毒（influenza A virus，IAV）是分节段的单负链RNA病毒，总共8个片段，负链的意思是与mRNA的顺序刚好5'到3'反向互补，IAV也是反向遗传学体系非常成熟的模式病毒之一。IAV的8个片段编码的基因分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA、基质蛋白M、核蛋白NP、非结构蛋白NS，还有PA、PB1和PB2三个蛋白组合起作为病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。

对于反向遗传学操作，现在一般是8质粒系统，也就是8个基因片段构建的双向载体，可以同时翻译蛋白和转录出负链基因组，所以，转染8质粒就可以获得流感病毒了，这一点是文章里对病毒进行突变的基础。

文章里所用的系统是Peter Schultz研究团队最早建立起来的，这也是合成生物学里很有前景的一个分支。化学上，正交的目的是标记蛋白质等生物大分子，而且是不影响蛋白本身功能的化学基团进行标记。而所谓正交遗传系统，大概意思，或者说重点就是把自然界生物体内不存在的20个氨基酸以外的氨基酸（Unnatural Amino Acids）标记到生物体内，这样就可以有不同的氨基酸侧链，而这些侧链可以比方说带上荧光基团等等。

我们知道生物体内的20种氨基酸是由三联码编码的，ATCG四种核苷总共有64种三联码，编码氨基酸的已经占去了61个，还有3个分别是TAA、TAG和TGA三个终止密码子（TAG：amber；TAA：ochre和 TGA：opal）。Peter Schultz他们利用了TAG/amber作为添加新氨基酸的位点，那是怎么实现的呢？TAG作为本来就有的终止码，首先要做的就是把细胞里配对这个TAG的tRNA CUA给抑制掉，换成携带20种氨基酸之外新氨基酸的tRNA CUA，这样就可以在正常基因TAG的位置添加新氨基酸了。

如上图所示，正交的氨基酸核糖体aaRS（红色）结合正交的tRNA CUA（蓝色，CUA碱基位红色），结合一个非天然的氨基酸（R基团为蓝色X），而不与天然的aaRS/tRNA结合对交联（左边灰褐色的是天然的配对体系）。下一步就是正交的ssRS复合物结合到mRNASHANG UAG的三联码上，进而本来应该终止的三联码编码了一个新的非天然的氨基酸。可以添加的氨基酸现在已经很多很多了，北大这篇文章用的是Nɛ-(2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine) 。

技术方法

作者首先是构建了一株细胞系，把正交翻译系统（orthogonal translation system）导入到人胚肾293T细胞中，使用的正交系统是正常情况下20个氨基酸以外[orthogonal unnatural amino acid (UAA)]的Nε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine，配对的系统是Methanosarcina barkeri MS pyrrolysyl tRNA synthetase（tRNA合成酶）/tRNACUA，同时这个细胞里面稳转了一个绿色荧光蛋白（GFP）基因，但是跟普通的GFP基因不一样的是在一个特定位置有一个被修改过的位点，也就在39位TAG终止了。所以在这个细胞系里，也就是不添加UAA（Nε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine）的时候，GFP是不表达的【图1B】，但是添加UAA之后，这个终止密码子就可以翻译了，也就是加入UAA细胞就变绿了。同时这个细胞系构建出来后比较稳定，增殖200代这些表型也没问题。而且，用这个细胞转染8质粒系统产生的流感病毒与正常的细胞产生的流感病毒在滴度上没有差别【图1C】。

Fig.1 Establishment of a virion packaging system that is compatible with the orthogonal translation machinery

下边开始就是重头戏了，利用这个正交系统的293T细胞，作者在流感病毒NP上随机选了一个位点（Asp101），进行了突变，也就是说在普通细胞中转染8质粒系统的时候NP是不完整的，不能翻译出NP，所以这个突变后的NP质粒，只有在正交系统293T细胞中才能产生流感病毒。作者称为PTC virus（premature termination codon），在这个细胞中添加UAA，病毒是可以包装出来的【图1D】，而且也只能在这个细胞上，并且在添加UAA的情况下，细胞才能出现CPE【图1E】。

所以作者构利用8质粒系统，在NP上添加终止码之后，获得只能在正交系统293T细胞添加UAA的情况下包装出来的病毒，而且这个病毒的NP基因组是有终止码突变的——在正常细胞中并不能复制【图1A】。

我们知道流感和艾滋的疫苗为什么难弄，就是因为基因组的突变快，导致抗原变异，那么会不会这种终止码突变的毒株也会突变回来呢？

作者为了验证这个问题，就在NP随机突变了好多个三联码位点【图2A】，然后发现这些突变的病毒增殖的动力其实区别不大【图2B】，而且都不能在正常细胞上复制【图2C】。除了NP之外，流感不是8质粒吗，作者又在除了HA和NA之外的质粒上进行了突变（这两个是主要的中和抗体靶标），结果也都差不多，只在HA-Lys57，NS-Phe103，PB2-Gln13，PB2-Thr35，M2-Lys49，M2-L等位点上回复突变率要高几个数量级，并最终逃脱了UAA依赖。

Fig.2 Genome-wide investigation and characterization of the PTC influenza viruses.

所以，既然有回复突变的可能，那么是不是在设计的时候就多用几个同时突变的终止位点不就能大大降低回复概率吗？——单点突变的回复突变率是1.0 × 10E−8 (PTC-1)，双点突变是1.2 × 10E−10 (PTC-2)， 三点突变就基本上检测不到了 (<10E−11)【图2C】。 

再进一步，作者想看看在（动物）体内的回复突变的可能，作者选了一个毒株（PIC-4A）作为代表【图2D，E】，在小鼠、豚鼠和雪貂上进行实验（常用的流感动物模型）；

在小鼠模型中，WSN毒株通常在半数致死量是8 × 10E3 PFU，而用10倍 LD50的时候（也就是8 × 10E4 ），小鼠会全部死亡【图3A左】，而且体重会显著降低。但是PTC-4对照组中，这种病毒即使用到了10E9 PFU，也就是比正常LD50高10E5，都不会有小鼠死亡，体重也不会减轻【图3A右】。攻毒三天后小鼠各脏器的病毒载量，PTC-4、减毒活疫苗（温度敏感株）和野毒株在鼻/turbinate，气管/trachea和肺脏/lung里的病毒载量分别是10E1.6、10E1.5、10E1.3 PFU/g ，10E3.5、10E2.9、10E1.8和10E5.5、10E5.7、10E6.5【图3B】。

前面也说了，PTC-4这种密码子突变的病毒在正常细胞上是不会复制的，所以在正常细胞中也不会产生空斑【图3C】，在正交细胞添加UAA的情况下才有空斑形成。

而且，在同笼培养的豚鼠中，接种过PTC-4的豚鼠并不会把病毒传染给其他未接种的豚鼠，而在野生型和减毒疫苗组中，这是普遍现象（流感毕竟是空气传播的）；

所以，三种动物的实验都证实了突变病毒是非常安全的。

Fig.3 Characterization of the in vivo safety of the PTC viruses.

既然突变病毒很安全，也基本不会回复突变，那么作为疫苗来说免疫效果咋样呢？作者比较了PTC-4A 和灭活疫苗IIV（inactivated influenza vaccine）以及减毒疫苗 CAIV。

10E6 PFU 免疫小鼠，10E7 PFU 免疫雪貂和豚鼠。三周后，全病毒疫苗—— PTC-4A 和CAIV免疫后的血清都具有强烈的血凝抑制/HAI和中和/NT效应；而灭活疫苗即使在免疫两次后效果也不明显【图4A左1+2】。

而PTC-4A 在此免疫后，可以诱导血凝抑制抗体和中和抗体水平上升6~8个级别（如果是2倍倍比稀释的话，倍数也就是64~256倍）【图4B】。而且黏膜免疫的主要抗体IgA只在PTC-4A和CAIV上被诱导出来，而灭活疫苗没有（很好理解，因为只有活病毒才有类似正常感染的效果）【图4A右2】。

因为抗体都是体液免疫应答，对于病毒感染来说，细胞免疫应答也很重要，这部分主要是杀伤性的T细胞（cytotoxic T lymphocytes/CTL），PTV-4A和CAIV诱导的CTL是灭活疫苗的10倍以上，灭活疫苗只在肺部具有正基线水平的CTL【图4A右】。

那既然纸面上的免疫效果这么好（抗体和CTL是做疫苗最常用的评价指标，分别代表体液免疫和细胞免疫），但是，既然作为疫苗，最主要的还是要看保护效果，所以，最后一点是看PTV-4A的保护效果，还是跟灭活苗和减毒苗相比较。每组15只，免疫3周后，动物经鼻腔攻毒50倍LD50的野生型病毒，攻毒3天后，每组处死5只，用于滴定肺部的病毒载量；在减毒苗和PTV-4A的免疫组，尤其是两次免疫组，病毒滴度下降了1000倍，体重也没啥变化，而且所有PTV-4和CAIV组的剩余动物全部存活【图4D】。

Fig.4 Characterization of the immunogenicity and protective efficacy of the PTC-4A virus in BALB/c mice that were intranasally inoculated with one or two doses.

作者又测试了，这一种突变病毒是不是对其他抗原类别不一样的流感病毒也有保护作用？（大家应该也清楚什么H9N1，H5N6，H5N1，H1N1等等，这些都是不同的抗原型别）15只小鼠，单次免疫PTV-4A，再用10E6 PFU的重组H1N1或者H3N2（ influenza A/reassortant/NYMC X-179A (pH1N1) or A/Aichi/2/68 (H3N2) viruses）来攻毒，结果发现保护效果也很好，病毒滴度降的也多，这可能是共同的保护抗原和病毒特异的CTL起到的保护作用。

其实到这一步文章已经非常完美了，但是这篇文章居然还有一个更为亮点的信息。

因为对于其他正常的减毒活疫苗来说，跟野生病毒混合，会恢复原来的毒性。但是作者发现，把PTV-4A跟野生型病毒去混合，反而大大降低了原来病毒的滴度，这应该就是不同的基因组会重组，但是野生型的重组了PTV-4A的突变基因组反而把自己的复制能力给丧失了。这就有意思了，也就是说这种疫苗还具有治疗性的作用！

总结

先贴出原文：

Our results show that we succeeded in generating live but replication-incompetent virus vaccines by applying genetic code expansion to the influenza virus genome. Such live vaccines elicited robust immunity against both parental and antigenically distinct strains. Generation of such PTC virus vaccines can be potentially adapted to almost any virus so long as their genome could be manipulated and packaged in a cell line. Furthermore, the multiple PTC-harboring viruses are not only prophylactic but also therapeutic vaccines in the neutralization of the replicating viruses.

其实就是两条，非常impressive。

1.只要是能反向遗传操作的病毒，都能这样用特殊细胞系来制备疫苗，太帅了。

2.疫苗不光能发挥预防作用，还能发挥治疗作用，更帅了。

最后想说的是，虽然我等非相关专业吃瓜群众想完全理解这篇文章中的技术方法是一件非常困难的事情，但大家都应该会深刻感觉到中国在前沿科技领域取得的突破是越来越多，这种量变的积累必然会迎来爆发的时候，中国的新药研发也有望在某一领域引领全球。