香港中文大学的研究人员及其合作者开发了一种通用方法，用于单基因疾病的无创产前检测（NIPT），使用该方法不需要了解受影响家庭成员中诱发特定疾病的突变或DNA信息。这项概念验证研究近日发表在《Clinical Chemistry》杂志上。

文献来源：Universal Haplotype-Based Noninvasive Prenatal Testing for Single Gene Diseases.

该方法使用10x Genomics公司的linked-read测序技术，分析父母亲基因组的单倍型并鉴定致病基因位点周围的SNP。然后进行母体血浆DNA测序和相对单倍型剂量（relative haplotype dosage，RHDO）分析，以推测胎儿的突变状态。

文章通讯作者、香港中文大学化学病理学系教授Rossa Chiu表示， “我们认为这是NIPT的一项重要成就。”

研究者在单基因病NIPT开发上的尝试

NIPT已被广泛地用于胎儿染色体非整倍体检测，但是到目前为止NIPT还没有被广泛地用于单基因疾病检测，这是因为实验室需要为他们想要分析的每个突变设计一个新的检测方法。Chiu说，“我们这种简化的方案，将使单基因疾病的NIPT变得更普遍，因为每个实验室只需要学习一种方案即可。”

一般来说，如果父母双方都是携带者，通常推荐他们进行产前检测，当前通常使用的是侵入性方法，例如羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样，但这类方法具有小的流产风险。为了避免这种风险，研究人员一直在开发无创产前方法来诊断单基因疾病。

2008年，Chiu和卢煜明等发表了一种称为相对突变剂量（relative mutation dosage）的方法，可以确定母体血浆中突变的相对量和致病基因的野生型等位基因。这种方法需要针对每个突变设计特异性检测，然后推测出胎儿是否受影响。

虽然这种使用数字PCR的方法相对便宜，但对于一些突变，很难设计一种效果良好的检测，并且该方法需要一定的胎儿DNA比例（fetal DNA fraction）。例如，在先天性肾上腺皮质增生症中发生突变的21-羟化酶基因具有高度同源的假基因，因此很难针对高度片段化的母体血浆DNA进行检测。此外，定制检测有时需要很长时间才能开发和优化。

2010年，Chiu和卢煜明的研究团队发表了一种基于测序的方法，来对整个胎儿基因组进行基因分型（genotype）。这个方法依赖于母体血浆DNA测序，并将测序数据与使用相对单倍型剂量（RHDO）分析得到的父母亲单倍型进行比较。Chiu解释说，“这个概念与相对突变剂量相似，但不同的是，新方法不再依赖于特异性突变检测。”他们后来使用这种方法，靶向测序基因组上的一段6 MB区域，来无创性地诊断先天性肾上腺皮质增生症，这项研究发表在2014年。

除了避免针对特异性突变设计检测，RHDO更敏感，因为它使用更多的测序read，而不是仅仅分析直接围绕突变位点的read。这种方法原本存在的瓶颈在最新的研究中得到了解决：通过对父母亲的基因组进行单倍型分析。

Chiu说，“单倍型分析做起来并不容易。”在之前的研究中，他们使用以前受影响儿童的DNA来做单倍型分析，但这样的检测仅限用于有受影响成员所在的家庭。他们还尝试了其他单倍型分析策略，包括Illumina的Moleculo技术，但是相当繁琐，有时还需使用基于人群的单倍型数据来填充缺口。

新开发的通用方法利用了父母亲DNA的单倍型分析

在这项最新的研究中，研究人员使用10x Genomics公司的linked-read技术，结合Illumina测序，对父母亲的DNA进行单倍型分析。该方法将长DNA片段包裹到凝胶珠上，然后DNA被片段化和条形码（barcode）标记。测序后，基于条形码将DNA片段重新组装成单倍型。Chiu说，“我们如今可以方便地对父母亲的DNA进行单倍型分析。”然后分析母体血浆DNA，以了解胎儿是否患病。

研究人员招募了13个可能生出患单基因疾病胎儿的家庭，包括先天性肾上腺皮质增生症、β-地中海贫血和血友病。

在分析了父母亲单倍型并确定致病基因位点附近的SNP后，研究人员使用RHDO方法解释母体血浆DNA的测序数据。这使他们能够准确地确定12个家庭的胎儿突变图谱，最后一个家庭的血浆DNA样本中没有足够的SNP信息。

Chiu说，在某些情况下，使用靶向测序而不是全基因组测序来降低总成本，但对一些疾病，他们没有针对致病基因位点的捕获探针，只能采用全基因组测序。

他们的检测方案操作起来需要1~2周时间，但是费用仍然相当昂贵，尤其是10xGenomics的试剂费用，总的来说，未优化方案的试剂费用至少为2000美金。另一个局限性是该方法不适用于三核苷酸重复疾病，因为该方法无法判断从携带者母亲遗传来的DNA重复是否会在胎儿中进一步扩增，这可能导致疾病。

后续研究计划

研究人员下一步计划进行验证研究，理想情况下会招募数百个家庭，以证明检测的准确性。但是这样的招募需要时间，因为任何一种单基因疾病的发病率都很低。例如香港8%的人是地中海贫血的携带者，每年约120对夫妇的胎儿有患病的风险。然而，整体来看，单基因疾病是一个巨大的负担，除了染色体非整倍性，单基因疾病是人们进行产前诊断的另一个主要原因。

这种检测方法的应用方向包括：对有遗传病史的家庭，能够发现他们的胎儿是否可能患病；被确定为同一种疾病的携带者但没有疾病史的夫妇来使用；超声发现结构异常可能指示单基因疾病的家庭使用。

Chiu最后强调，虽然现在谈该检测的商业开发还为时过早，但这项技术具有很大的商业潜力。